(精心整理)ELISA试验基本步骤及材料和试剂

ELISA基本步骤和主要试剂、材料注意：本步骤为间接ELISA步骤一主要步骤1包被取所要包被的物质，提前 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 好所需浓度，根据包被孔数计算所需包被物的量，用包被液稀释至所需体积，分加至各孔中。包被条件：两种选择：一是将ELISA板直接置4℃过夜；也可以先置37℃孵育2小时再转入4℃过夜。2洗涤包被结束后弃掉包被液，用PBST进行洗涤， 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 为PBST加满每孔，静置5-10min，弃掉洗液，重新加满，重复洗涤3-5次，最后拍干ELISA板等待下一步封闭。3封闭常用10%小牛血清，取第2步的ELISA板加封闭液至每孔，体积至少为所加包被液的两倍。封闭条件也有两种选择：直接置于4℃过夜，或者置于37℃温育2-4h，具体何种条件不同物质的ELISA可能不同。4洗涤封闭结束的ELISA板进行洗涤，方法同步骤2。最后拍干等待加入一抗。5加入一抗一抗即为你要检测的物质，一般加之前需要稀释，具体稀释倍数不同实验不同需要自己摸索。一抗样品一般用包被液稀释，稀释到所需浓度后加入到相应孔中。

反应条件为37℃孵育2h。6洗涤具体同步骤4。7加相应HRP-标记的商品化二抗加相应的商品化HRP-标记的二抗（如一抗为鼠源物质则对应加抗鼠二抗），一般也用封闭液稀释，稀释倍数参考二抗说明 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 。将稀释好的二抗加入各孔，37℃反应1-1.5h。8洗涤具体同步骤4。9显色常用OPD作为显色底物，但OPD致癌，也有用TMB作为底物，，这里只介绍前者。显色需要配置显色液，具体方法为：在步骤8进行到一半使配置显色液，为10ml底物缓冲液加0.015gOPD粉末（实际操作由于OPD有毒不方便称量故只需稍微加入一点即可），等待OPD完全溶解。待步骤8完成后取150ul3%过氧化氢溶液加入之前配置的10ml溶液中混匀，立即将此显色液分加至ELISA各孔中。然后将ELISA板置于37℃反应约10min。10终止将ELISA板取出，每孔加终止液（2mol/L硫酸溶液）终止反应，立即到酶标仪上读数（OPD为底物是读数波长为490nm，TMB为底物时波长为450nm）。二材料、试剂1ELIS

A板专用于EILSA的产品称为ELISA板，国际上 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 的微量滴定板为8×12的96孔式，需要购买。常用聚苯乙烯和聚氯乙烯材料。注意：聚苯乙烯材料目前只有进口，特点是孔大，加满约300ul，此时实验中所加各试剂（包被液、一抗、二抗、显色液、终止液等）均为100ul体积。而聚氯乙烯多为国产，孔较小，加满约200ul，此时各试剂只需加50ul体积即可。2各试剂配制1）包被液（PH6.3的碳酸盐缓冲液）无水Na2CO30.1696gNaHCO30.2856gSW100ml完全溶解至4℃,一周内使用2）PBST配方NaCl8.0gNa2HPO4.12H2O2.9gKCl0.2gKH2PO40.24gTW-200.5mlSW1000ml3)底物缓冲液Na2HPO43.682g柠檬酸1.02gDW200ml不需灭菌，4℃保存4）3%H2O230%H2O2100mlSW900ml5）显色剂底物缓冲剂10ml3%H2O2150ulOPD15mg其中H2O2最后加6）终止液浓硫酸：SW

=1:8浓硫酸缓慢加入到SW中，并搅拌散热三注意事项1包被所谓37℃反应，一般取一个37℃的水浴锅，在水面放一较大泡沫板，将ELISA板置于泡沫板上即可，其余步骤的37℃反应操作同此；整个ELISA过程中所有需要较长时间等待的步骤（包被、封闭、加一抗孵育、加二抗孵育）均需要将ELISA包起来再放入冰箱或水浴锅中，一般可直接用一次性EP手套套起来即可。2洗涤最常规的洗涤步骤是洗涤3次，每次间隔5min，具体实验可能会微调，洗涤次数可以3-6次不等，间隔5-10min不等；每次洗涤后要将ELISA板尽可能拍干后在进行下一步操作，尤其是每个洗涤步骤的最后一次洗涤要尽可能拍干，拍干可在纱布、吸水纸上进行，也可以购买洗板机。3显色配制显色液时3%过氧化氢一定要最后加入，加入混匀后立刻分装到ELISA板中，即在加过氧化氢前要完全完成洗涤的操作；OPD一般在倒数第二次洗涤前加入，要留有约10min时间以确保OPD完全溶解。其他未尽事宜可查阅相关资料。PAGE/NUMPAGES